ODS柱的沖洗方法

ODS色譜柱填充有十八烷基甲硅烷基（ODS基團(tuán)或C18基團(tuán)）與硅膠載體化學(xué)鍵合。ODS柱用于反相色譜。ODS 色譜柱因其高理論塔板數(shù)和快速平衡而具有廣泛的應(yīng)用。它們的低成本使其成為HPLC中使用zui廣泛的色譜柱。

然而，在使用這些色譜柱時(shí)可能會出現(xiàn)各種問題。下面介紹典型的原因和癥狀。隨后的解釋涵蓋了去除吸附成分的沖洗方法。

ODS色譜柱的典型問題

* 這些是主要原因和癥狀。可能存在其他問題。

(1) ODS柱填料表面（固定相）

在考慮沖洗方法時(shí)，重要的是要考慮作用在組件上的吸附力。 首先，我們將回顧我們對 ODS 填料表面的了解。

羥基zui初以 Si-OH 結(jié)構(gòu)附著在硅膠載體的表面。 這被稱為“硅烷醇”。 ODS 填料是通過化學(xué)反應(yīng)將 ODS 基團(tuán)與硅烷醇鍵合形成的。 但是，由于 ODS 基團(tuán)體積龐大且反應(yīng)性不高，因此會殘留大量未反應(yīng)的硅烷醇。

由于這種殘留的硅烷醇會在分析過程中產(chǎn)生各種不利影響*，因此硅烷醇會因與三 甲基甲硅烷基 (TMS) 基團(tuán)的反應(yīng)而受到限制，而三 甲基甲硅烷基 (TMS) 基團(tuán)并不龐大（反應(yīng)性高）。 該操作稱為“封端”、“三 甲基甲硅烷基化”或“二級甲硅烷基化”。 然而，少量的硅烷醇仍會保留在表面上，在分析過程中，ODS 基團(tuán)可能會逐漸去除以在 ODS 柱中產(chǎn)生硅烷醇。

*相反，一些商業(yè) ODS 柱包含一定量的硅烷醇，因?yàn)槟承┓治龇椒ɡ昧斯柰榇嫉奈阶饔谩?/span>

(2) 沖洗掉因疏水相互作用而殘留的成分

術(shù)語“疏水相互作用”表示具有低極性的組分區(qū)域和具有低極性的 ODS 基團(tuán)之間的親和力。 它是真正的反相色譜使用的保留力。 低極性區(qū)域包括烷基和芳環(huán)。 在右圖的頂部，組件的丙基被吸引到 ODS 基團(tuán)上。 低極性流動相用于沖洗被這種力保留的組分。 如果使用 1/1 的甲醇/水作為分析的流動相，例如，將甲醇比率增加到 3/1，會降低沖洗液的極性，并且更容易沖洗掉具有高保留力的組分。在列中。 更換流動相時(shí)必須考慮兼容性。 如果在上面的例子中使用緩沖溶液代替水，如果有機(jī)溶劑比例突然增加，鹽可能會沉淀出來。 如果使用緩沖溶液/有機(jī)溶劑混合物作為流動相進(jìn)行分析，則在增加有機(jī)溶劑比率之前，必須先用相同比率的水/有機(jī)溶劑混合物*沖洗色譜柱和流路。 在沖洗過程中，用檢測器進(jìn)行監(jiān)測以確定基線是否穩(wěn)定。

• 在用作沖洗液的流動相中加入少量酸通常是有益的。 這在下面的(3)中描述。 如果使用 100% 甲醇作為流動相，請使用極性較低的沖洗液，例如四氫呋喃 (THF)。

(3) 沖洗掉通過氫鍵或離子鍵吸附的成分

如上文 (1) 所述，少量硅烷醇?xì)埩粼谔盍媳砻妗? 硅烷醇中的氫將電子吸引到氧上以產(chǎn)生有點(diǎn)正的靜電荷。 因此，氫具有與元件中氮上的孤對（帶負(fù)靜電荷）形成氫鍵的特性。 （右上方圖表的中間一行）在弱酸性或中性流動相中，這種氫鍵會吸附堿性成分并導(dǎo)致拖尾。 （硅烷醇在較高的 pH 值下形成離子鍵。）強(qiáng)吸附的堿性成分不能被有機(jī)溶劑沖洗掉。 在這種情況下，必須使用酸性沖洗溶液通過將氫離子與氮上的孤對電子配位（質(zhì)子化）來限制氫鍵。 R-NH 2 → R-NH 3 + 加入大約 0.1% 的磷酸或醋酸制成酸性沖洗液。

一般認(rèn)為，強(qiáng)烈保留在柱內(nèi)的成分包括這樣的基本成分。 這是添加酸有利于上述(2)中的漂洗的原因。 如果堿性組分殘留在色譜柱中（包括使用堿性化合物作為離子對試劑時(shí)），請勿用水沖洗。 用水沖洗會增加吸附組分周圍的 pH 值，使硅膠易于溶解。 添加酸有助于避免這個(gè)問題。

然而，一些組分很難通過簡單地使流動相呈酸性來去除。 這是具有大離子半徑的陽離子的情況，例如四丁基銨。

在這種情況下，離子鍵被認(rèn)為是與解離的硅烷醇的負(fù)電荷一起發(fā)生的。 （圖表頂部） 隨著離子半徑的增加，離子鍵變得更強(qiáng)。 下圖顯示了在酸性條件下末端氨基帶正電的情況。 由于電荷密度高，會發(fā)生多層次的水合作用，這使得陰離子難以接近。 然而，由于被龐大烷基團(tuán)包圍的銨離子的水合作用很弱，陰離子可以更容易接近。

參考：在離子交換色譜過程中，離子洗脫從離子半徑小的離子開始：F - 、Cl - 和 Br - 。 這表明離子鍵隨著離子半徑的增加而變得更強(qiáng)。

要削弱離子鍵，請使用含有大半徑陰離子* 作為離子對的酸性沖洗液。 酸性會抑制硅烷醇的解離。 * 例如，添加大約 0.1 M 高氯酸鈉。 高氯酸鈉雖然是無機(jī)鹽，但具有溶于100%甲醇或乙腈不易沉淀的特性。 由于高氯酸根離子在流動相中容易形成離子對，因此也可用于離子對色譜。 （但是，這是一種危險(xiǎn)的試劑。不要加熱它或?qū)⑺旁诿骰鸶浇U液稀釋到中性狀態(tài)，并通過有執(zhí)照的廢物處理承包商進(jìn)行處理。）

補(bǔ)充

當(dāng)硅烷醇解離時(shí)，它帶有負(fù)電荷。當(dāng)與金屬離子結(jié)合時(shí)，它促進(jìn)了配位化合物和酸性化合物的吸附。 為了沖洗掉金屬離子，將競爭性離子物質(zhì)或金屬掩蔽劑添加到?jīng)_洗溶液中。 此外，由于需要限制硅烷醇的解離，因此降低流動相/沖洗溶液的 pH 值是有效的。

此外，使溶液呈酸性會削弱配位化合物的配位并限制酸性化合物中羧基的解離。 但是，由于硅膠在pH值4左右較為穩(wěn)定，因此禁止長時(shí)間使用極酸性的溶液。 理想情況下，使用少量磷酸或乙酸。

(4) 總結(jié)

我們在上面描述了使用有機(jī)溶劑/緩沖溶液混合物作為分析流動相的常見程序是：1) 用相同混合比例的有機(jī)溶劑/酸水混合物沖洗，2) 使用酸性沖洗液沖洗增加有機(jī)溶劑的比例，3) 如果預(yù)計(jì)會包含強(qiáng)堿性化合物，請?jiān)跊_洗液中加入高氯酸鈉。

但是，每次分析的zui佳沖洗方法都不同。 在確定沖洗方法時(shí)，請始終牢記樣品所含的成分以及使用的流動相。 即使 ODS 柱使用相同的硅膠載體，使用限制也可能不同。 仔細(xì)閱讀使用說明書。