高效液相色譜法（HPLC）因其定量分析結(jié)果準(zhǔn)確、分析周期短、分析范圍廣、分析檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，近年來得到了迅速發(fā)展，幾乎可以應(yīng)用于所有大分子有機(jī)物的分析。
可以預(yù)見，高效液相色譜儀器的應(yīng)用將在農(nóng)業(yè)、輕、重、海、陸、空、食、衣、用等各個(gè)領(lǐng)域無處不在，無處不在。但是，如何用好高效液相色譜柱是一個(gè)非常關(guān)鍵的問題。
1、高效液相色譜柱及柱外相關(guān)問題
1）色譜峰拖尾：與色譜柱、流動相流速、樣品等有關(guān)，必須從這些方面找出拖尾的原因。
2）如何延長色譜柱的壽命：維護(hù)很重要。長期不使用時(shí)，用甲醇浸泡。嚴(yán)格控制洗柱時(shí)間或洗柱溶劑的體積。一般應(yīng)使用甲醇（或水：甲醇為20：80）洗滌45分鐘或床體積的20倍。
3）必須注意控制“柱外效應(yīng)”。所謂“柱外效應(yīng)”，是指在 HPLC 系統(tǒng)中，由于管子、連接件、進(jìn)樣器、流通池以及柱系統(tǒng)的死體積所引起的色譜峰展寬效應(yīng)。
4）進(jìn)樣：自動進(jìn)樣時(shí)，應(yīng)經(jīng)常對自動進(jìn)樣器進(jìn)行檢測，要求儀器進(jìn)樣器穩(wěn)定可靠；手工采樣時(shí)，要特別注意采樣的細(xì)節(jié)和感覺。
2、高效液相色譜柱質(zhì)量
1）色譜柱的柱效：塔板數(shù)越高越好，要特別注意影響柱效的因素。塔板數(shù)下降到一定程度時(shí)報(bào)廢。
2）重復(fù)性：當(dāng)色譜柱重復(fù)使用時(shí)，zui大RSD可保持在0.1%以下。
3）耐久性（壽命）：因?yàn)橹菀捉档?，所以要注意柱子保護(hù)。
4）色譜柱使用后必須清洗干凈，以免腐蝕、堵塞、減少塔板數(shù)。一般應(yīng)以床體積的20倍沖洗。 對于每隔幾天使用的HPLC，應(yīng)先用20%甲醇：80%水洗30分鐘左右，然后再用純甲醇洗20分鐘后保存。
3、流動相問題
1）pH值特別重要：一般C18柱的pH值小于3時(shí)，很容易損壞色譜柱，但小的pH值可用于耐酸柱。
2）請注意試劑截止波長的選擇：如乙腈截止波長215nm、丙酮截止波長330nm、正丁烷210nm等。
3）流速：流速要合適，否則會影響峰形，浪費(fèi)溶劑。一般常規(guī)分析通常選擇1ml/min。
4、溶劑預(yù)處理 zui好使用HPLC級的溶劑，使用前必須過濾脫氣。請注意以下事項(xiàng)：
1）過濾目的： 溶劑進(jìn)泵前和進(jìn)樣前應(yīng)過濾除去溶劑中的微小顆粒和微生物，以保證泵和色譜柱不會堵塞或損壞，分析數(shù)據(jù)要可靠。
2）對過濾器的要求及zui大孔徑的選擇方法： 對過濾器的一般要求：速度快、溶解速度小、死體積小、孔徑精 確、體積合適、化學(xué)相容性好等。
對于孔徑選擇方法：如果柱填料直徑小于3μm或無菌過濾，一般選擇0.2μm孔徑；如果柱填料直徑大于5μm，選擇0.45μm；如果是預(yù)過濾或過濾困難的樣品，一般選擇1μm孔徑。 尤其是用無機(jī)鹽配制的緩沖液，更要注意選擇合適的過濾器。否則，不可能得到可靠的分析和測試數(shù)據(jù)。
3）脫氣：
主要目的是去除溶解在流動相中或混合產(chǎn)生的氣泡。液相色譜中zui常用的流動相脫氣是離線超聲振動脫氣、在線惰性氣體鼓泡吹掃脫氣和在線真空脫氣。進(jìn)入液相泵的流動相中的氣泡會引起壓力波動，這是非常有害的，必須消除?？梢源蜷_排水閥以高流速沖洗。
5、緩沖溶液
1） 緩沖液在使用前必須過濾。
2）溶劑和樣品容易滋生**和霉菌，因此請對其進(jìn)行清潔。
3）一般有機(jī)溶劑不能直接用于清洗和洗滌。
4）梯度洗脫時(shí)，選擇吸光值低的緩沖液，例如：梯度洗脫時(shí)，緩沖液與相應(yīng)的有機(jī)物預(yù)混以防止鹽析。在峰不拖尾的情況下，盡量使用低濃度的緩沖鹽，防止鹽析；緩沖鹽濃度一般在20～30mm左右。
如果流動相中有機(jī)相含量較高，則流動相中緩沖鹽的濃度不能太高，鹽濃度至少要保證在流動相條件下不會沉淀。離子對緩沖液的濃度要高一些，一般為50-100mm。
6、噴油器的清潔 對于注射器或注射針，請注意三點(diǎn)：
1）對進(jìn)樣器的要求：自動進(jìn)樣，進(jìn)樣速度快，有的儀器進(jìn)樣只需17秒。
2）采樣室要求可控：一般采用Peltier冷卻，溫度控制范圍為4℃-100℃。
3）要特別注意注射殘留物的清潔（主要是清潔針頭）。
